cellZscope - Impedanzbasiertes Zell-Monitoring
von schneller Tight-Junction-Dynamik (TJ) bis zur Langzeit-Zellschichtbildung
Die Impedanzspektroskopie ist die ideale Methode zur Analyse und Überwachung von Zellkulturen unter physiologischen Bedingungen. Sie funktioniert Marker-frei, benötigt keine Fixierung oder Färbung und ermöglicht es, die zu untersuchenden Zellkulturen für nachfolgende experimentelle Schritte am Leben zu erhalten. Diese Merkmale, kombiniert mit einem hohen Automatisierungsgrad bei der Datenerfassung und -analyse, machen das cellZscope® zum perfekten Werkzeug für die In-vitro-Untersuchung von Epithel- oder Endothelzellen. Das cellZscope eignet sich gleichermaßen zur Überwachung schneller Dynamiken im Tight-Junctions-Netzwerk sowie zur Langzeitüberwachung zellulärer Prozesse wie Schichtbildung, Differenzierung und Polarisation.
Tight Junction-Dynamik
Die Barriereeigenschaften von Epithel- und Endothelzellschichten werden maßgeblich durch die im Interzellularraum befindliche Tight Junctions bestimmt. Da sie für eine Abdichtung zwischen dem apikalen und dem basolateralen Membranbereich sorgen, haben sie einen starken Einfluss auf die parazelluläre Durchlässigkeit. Die Barrierefunktion ist nicht statisch sondern kann durch gezielte Reize bewusst moduliert werden. Die daraus resultierende Dynamik des Tight-Junction-Netzwerks kann bequem durch Messung des transepithelischen/ -endothelischen elektrischen Widerstands (TEER) mit dem cellZscope verfolgt werden. Die folgende Abbildung zeigt die Wirkung verschiedener EGTA-Konzentrationen auf Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK), die auf den Membranen von Standard-Zellkultureinsätzen gezüchtet wurden.
Bekanntermaßen führt dieses Reagenz zu einer Verarmung an extrazellulärem Ca2+, was wiederum zu einem Auflösen der Tight Junction führt [1, 2]. Letzteres spiegelt sich in einem deutlichen Abfall der TEER-Werte wider. Ersetzt man anschließend das EGTA-enthaltende Mediums durch Standardmedium, regeneriert sich das Tight Junction-Netzwerk und die TEER-Messwerte steigen folglich wieder an. Zur Validierung des vorübergehenden Zusammenbruchs der Barrierefunktion wurden zwei Zellkulturen fixiert und zur Immunfluoreszenz-Analyse der Zellkerne und ZO-1-Proteine gefärbt. Mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop kann deutlich der durch die EGTA-Exposition induzierte Zerfall des Tight Junctions-Netzwerks im Vergleich mit der unbehandelten Referenzzellkultur gezeigt werden. Diese Ergebnisse stimmen hervorragend mit dem Verlauf der TEER-Messung überein und zeigen deutlich die Vorteile der Verwendung einer markierungsfreien und nicht-invasiven Technik, wie sie im cellZscope zum Einsatz kommt.
Zellschichtbildung
Mit Hilfe der Impedanzspektroskopie zur Zellanalyse lassen sich natürlich nicht nur kurzfristige, dynamische Prozesse verfolgen. Die Zellkulturen können auch über mehrere Tage oder sogar Wochen überwacht werden. Durch die Möglichkeit, das Wachtum kontinuierlich unter Beibehaltung physiologischer Bedingungen zu beobachten, können die Einflüsse verschiedene Faktoren wie Aussaatdichte, Art des Wachstumsmediums, Konzentration des Serums, Art der Substratbeschichtung und Temperatur ideal untersucht werden. Die beiden Messparameter des cellZscopes, der transepithelische/transendothelische elektrische Widerstand (TEER) und die Zellschicht-Kapazität (Ccl), liefern wertvolle Informationen über den aktuellen Zustand der Zellen, während diese differenzieren und eine konfluente Schicht ausbilden. Caco-2 ist eine etablierte, aus dem menschlichen Dickdarm-Adenokarzinom stammende Zelllinie, die häufig für Arzneimitteltransportstudien verwendet wird. Für eine Verwendung als Darmpermeabilitätsmodell ist die genaue Kenntnis des Wachstumszustands der Zellschicht zwingend erforderlich. In dem unten gezeigten Experiment wurde das cellZscope eingesetzt, um die Schichtbildung und Differenzierung von Caco-2-Zellen zu verfolgen, wobei die automatisierte Datenaufzeichnung direkt nach der Aussaat gestartet wurde und sich über einen Zeitraum von insgesamt mehr als drei Wochen erstreckte.
Abgesehen vom Mediumswechsel in regelmäßigen Zeitabständen waren keine manuellen Eingriffe zur Aufzeichnung der Daten notwendig. Somit konnten während des gesamten Experiments optimale physiologische Bedingungen aufrechterhalten werden. Es lassen sich im Zeitverlauf deutliche Unterschiede im Wachstumsverhalten der beiden unterschiedlichen Caco-2-Zelllinien beobachten. Auch hier lässt sich das cellZscope perfekt zur Qualitätskontrolle für Zellschichten einsetzen und hilft beim Festlegen/Überprüfen von gut definierten Startbedingungen für nachfolgende Experimente wie z.B. Permeabilitätsstudien.
nanoAnalytics dankt K. Hardes, V. Heitmann, J. Hüwe, M. Kahns, K. Riehemann (Westfälische Wilhelms-Universität Münster) für ihre umfassende Unterstützung.
[1] Rutten, M.J., Hoover, R.L., Karnovsky, M.J., Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures, Brain Res. 425, 301 (1987).
[2] Rothen-Rutishauser, B., Riesen, F.K., Braun, A., Günthert, M., Wunderli-Allenspach, H., Dynamics of Tight and Adherens Junctions Under EGTA Treatment. J. Mem. Biol. 188, 151 (2002).
