Überwachung der Barriereeigenschaften (TEER) von MDCK-Zellschichten
während des Abbaus von Zellcholesterin durch Methyl-beta-Cyclodextrin
Plasmamembranlipide wie Cholesterin spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Barrierefunktion von Epithelzellschichten. Lipide tragen zur Struktur, zum Aufbau und zur Funktion von Tight Junctions bei und wirken sich dadurch auf die selektive Permeabilität des parazellulären Signalwegs aus. Ein verbreiteter In-vitro-Ansatz zur Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen besteht darin, die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran selektiv zu verändern und dann analytische Techniken einzusetzen, um mögliche Auswirkungen auf die Barriereeigenschaften zu bestimmen. In dieser Studie wurden auf Inserts gezüchtete Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) unterschiedlichen Konzentrationen von Methyl-ß-Cyclodextrin (MBCD) ausgesetzt. Dieses Mittel dient als Cholesterin-bindendes Reagenz und erlaubt es dadurch, den Gehalt an zellulärem Cholesterin selektiv zu senken.
Durch messen des transepithelischen/transendothelischen elektrischen Widerstands (TEER) und der und Kapazität (Ccl) liefert das cellZscope® wertvolle Informationen über die Barriereeigenschaften und das Differenzierungsstadium von Zellschichten. Im Gegensatz zu anderen Analysetechniken können diese elektrischen Messungen markerfrei an lebenden Zellen durchgeführt werden, wodurch sie für weitere Experimente uneingeschränkt nutzbar bleiben. Dies macht das cellZscope zum perfekten Werkzeug für die Überwachung von Zellen, während sie konfluent wachsen und sich differenzieren. Sobald das Zellwachstum einen Gleichgewichtszustand erreicht hat, können nachfolgende Experimente durchgeführt werden, während das cellZscope weiterhin die für die Charakterisierung der Barrierefunktion und des Differenzierungsstadiums wichtigen, elektrischen Parameter misst.
Überwachung der Zellschicht und Ausbildung der Junctions
MDCK-II Zellen wurden in in serumhaltigem Medium in Standard-Inserts (Corning, Transwell®, #3401) auf einer Polycarbonatmembran (Porendichte 1×108/cm2, Porengröße 0.4 µm) ausgesät (Aussaatdichte 5×105 Zellen/cm2). Nach 10 Stunden, in denen sich die Zellen auf der Membran ansammeln konnten, lies sich die Ausbildung einer differenzierten Zellmonoschicht mit etablierten Zell-Zell-Junctions mit dem cellZscope durch Messung des elektrischen Widerstands und der Kapazität verfolgen. Das untenstehende Diagramm zeigt die stündlich automatisiert aufgenommenen Daten für einen Zeitraum von 60 Stunden.
Zeitlicher Verlauf des transepithelischen/transendothelischen elektrischen Widerstands (TEER) und der Kapazität von MDCK-II-Zellen. Das cellZscope ermöglicht eine kontinuierliche Datenaufzeichnung, während die Zellkulturen ungestört im Inkubator verbleiben.
Sobald sich die Tight Junctions ausbilden, kann ein deutlicher Anstieg des TEER Wertes ausgemacht werden. Nach etwa 8 Stunden hat sich ein vollständiges Netzwerk an Tight Junctions etabliert und der TEER erreicht sein Maximum. Die anschließende Abnahme des TEERs ist auf eine zunehmende Zellzahl pro Fläche zurückzuführen, d. h. die Gesamtumfangslänge parallel geschalteter Zell-Zell-Kontakte nimmt zu. Als Folge nimmt der Gesamtwiderstand des Netzwerks, d. h. der TEER, ab. Schließlich erreicht der TEER nach etwa 40 Stunden einen konstanten Wert. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Medium durch serumfreies Medium ersetzt. Anschließend wurde die Zellschicht weitere 20 Stunden analysiert.
Überwachung der Barrierefunktion und Zelldifferenzierung
Der Wechsel zu serumfreiem Medium wurde durchgeführt, um den Cholesteringehalt im Medium vor der MBCD-Behandlung zu minimieren. Somit kann MBCD weiterhin zur selektiven Senkung des Zellcholesterinspiegels führen. Dann wurden unterschiedliche Konzentrationen von MBCD in das obere Kompartiment, d. h. auf die apikale Seite der Zellschichten, der Wells hinzugegeben. Die Reaktion der MDCK-Zellen wurde durch Überwachung von TEER und Ccl mit dem cellZscope analysiert.
Zeitverläufe von TEER und Ccl zeigen eine dosisabhängige Reaktion der MDCK-II-Zellen auf die MBCD-Zugabe (gestrichelte Linie). Die Datenpunkte stehen für den berechneten Mittelwert und die Fehlerbalken für die Standardabweichung von drei Wells.
Der zu beobachtende anfängliche Anstieg des TEER ist aus der Literatur gut bekannt und verschiedene Interpretationen der zugrunde liegenden biochemischen Mechanismen wurden vorgeschlagen [1, 2]. Die mit dem cellZscope gemessenen Ergebnisse tragen zu laufenden Untersuchungen auf diesem Gebiet bei, da die Kapazität Ccl der Zellschichten als zusätzlicher, unabhängiger Ausleseparameter gemessen werden kann. Die zum TEER ergänzend aufgezeichnete Kapazität zeigt eine weitere dosisabhängige Veränderung der Eigenschaften der Zellschichten: Sie zeigt direkt morphologische Veränderungen der Zellschicht an.
Ergebnisse von zwei unabhängigen Experimenten, die die dosisabhängige Reaktion von TEER und Ccl der MDCK-II-Zellen auf die Cholesterinverarmung zeigen, 30 Minuten nach dem Treatment mit MBCD.
Die beobachtete durch die MBCD-Exposition Reduktion der Gesamtmembrankapazität stimmt mit unabhängigen Untersuchungen mittels konfokalen Mikroskopie überein [3]: Diese Studien zeigten, dass der Abbau von Zellcholesterin zur Retraktion von Oberflächenmikrovilli und Mikrokämmen führt. Folglich zeigt der Ccl-Verlauf eine signifikante, dosisabhängige Abnahme, da die elektrische Kapazität der Zellschicht direkt von ihrer Morphologie abhängt. Insbesondere das Zurückbilden von Protrusionen wie Mikrovilli und Mikrorippen bewirkt eine Verringerung des effektiven Oberflächenbereichs und führt dadurch zu einer Verringerung der elektrischen Kapazität. Das cellZscope ist darauf zugeschnitten, solche Veränderungen in der Plasmamembran während des gesamten Verlaufs eines Experiments zu detektieren und zu überwachen.
nanoAnalytics dankt K. Hardes and K. Riehemann (Westfälische Wilhelms-Universität Münster) sowie J. Wegener (Universität Regensburg) für die umfassende Unterstützung bei dieser Studie.
[1] Stankewich, M., Francis, S.A., Vu, Q.U., Schneeberger, E.E., Lynch, R.D., Alterations in Cell Cholesterol Content Modulate Ca2+-Induced Tight Junction Assembly by MDCK Cells. Lipids 31, 817 (1996).
[2] Francis, S.A., Kelly, J.M., McCormack, J., Rogers, R.A., Lai, J., Schneeberger, E.E., Lynch, R.D., Rapid reduction of MDCK cell cholesterol by methyl-ß-cyclodextrin alters steady state transepithelial electrical resistance. Eur. J. Cell. Biol. 78, 473 (1999).
[3] Colarusso, P., Spring, K.R., Reticulated Lipid Probe Fluorescence Reveals MDCK Cell Apical Membrane Topography. Biophys. J. 82, 752 (2002).
