Überwachung der Barriereeigenschaften (TEER) von MDCK-Zellschichten
während des Abbaus von Zellcholesterin durch Methyl-beta-Cyclodextrin

Plasmamembranlipide wie Cholesterin spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Barrierefunktion von Epithelzellschichten. Lipide tragen zur Struktur, zum Aufbau und zur Funktion von Tight Junctions bei und wirken sich dadurch auf die selektive Permeabilität des parazellulären Signalwegs aus. Ein verbreiteter In-vitro-Ansatz zur Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen besteht darin, die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran selektiv zu verändern und dann analytische Techniken einzusetzen, um mögliche Auswirkungen auf die Barriereeigenschaften zu bestimmen. In dieser Studie wurden auf Inserts gezüchtete Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) unterschiedlichen Konzentrationen von Methyl-ß-Cyclodextrin (MBCD) ausgesetzt. Dieses Mittel dient als Cholesterin-bindendes Reagenz und erlaubt es dadurch, den Gehalt an zellulärem Cholesterin selektiv zu senken.

Durch messen des transepithelischen/transendothelischen elektrischen Widerstands (TEER) und der und Kapazität (Ccl) liefert das cellZscope® wertvolle Informationen über die Barriereeigenschaften und das Differenzierungsstadium von Zellschichten. Im Gegensatz zu anderen Analysetechniken können diese elektrischen Messungen markerfrei an lebenden Zellen durchgeführt werden, wodurch sie für weitere Experimente uneingeschränkt nutzbar bleiben. Dies macht das cellZscope zum perfekten Werkzeug für die Überwachung von Zellen, während sie konfluent wachsen und sich differenzieren. Sobald das Zellwachstum einen Gleichgewichtszustand erreicht hat, können nachfolgende Experimente durchgeführt werden, während das cellZscope weiterhin die für die Charakterisierung der Barrierefunktion und des Differenzierungsstadiums wichtigen, elektrischen Parameter misst.

 

Überwachung der Zellschicht und Ausbildung der Junctions

MDCK-II Zellen wurden in in serumhaltigem Medium in Standard-Inserts (Corning, Transwell®, #3401) auf einer Polycarbonatmembran (Porendichte 1×108/cm2, Porengröße 0.4µm) ausgesät (Aussaatdichte 5×105 Zellen/cm2). Nach 10 Stunden, in denen sich die Zellen auf der Membran ansammeln konnten, lies sich die Ausbildung einer differenzierten Zellmonoschicht mit etablierten Zell-Zell-Junctions mit dem cellZscope durch Messung des elektrischen Widerstands und der Kapazität verfolgen. Das untenstehende Diagramm zeigt die stündlich automatisiert aufgenommenen Daten für einen Zeitraum von 60 Stunden.

 

Messen der Barrieredynamik (TEER) von MDCKII-Zellen im cellZscope

Zeitlicher Verlauf des transepithelischen/transendothelischen elektrischen Widerstands (TEER) und der Kapazität von MDCK-II-Zellen. Das cellZscope ermöglicht eine kontinuierliche Datenaufzeichnung, während die Zellkulturen ungestört im Inkubator verbleiben.

The initial steep increase in TEER clearly marks the onset of junction formation. This process was completed after 8 hours when TEER reached a maximum with full establishment of a tight junction network. The subsequent decrease in TEER can be attributed to an increasing cell number per surface area, i.e. the total perimeter length of cell-cell contacts connected in parallel increases. As a consequence the total resistance of the network, i.e. TER decreases. Finally, after approximately 40 hours TEER converged to a steady state level. At this time point the medium was replaced with serum-free medium and the cell layers allowed to adapt for further 20 hours.

 

Monitoring the barrier function and cell differentiation

The change to serum-free medium was performed in order to minimize cholesterol content in the medium prior to MBCD treatment. Thus MBCD kept its depletion potential for selectively lowering cell cholesterol levels. Then different concentrations of MBCD were added to the top compartment of the wells, i.e. to the apical side of the cell layers. The response of the MDCK cells was analyzed by monitoring TEER and Ccl with the cellZscope.

 

Dose dependent response of the MDCK-II cells to MBCD treatment

Time courses of TEER and Ccl exhibit a dose dependent response of the MDCK-II cells to MBCD treatment (dashed line). Data points represent the averaged mean and error bars the standard deviation of three wells.

The observed initial increase in TEER is well know from literature and different interpretations of the underlying biochemical mechanisms were suggested [1, 2]. The results obtained with the cellZscope contribute to ongoing investigations in this field by providing the cell layers’ capacitance Ccl as an independent readout parameter. This type of complemental data recorded simultaneously with TEER reveals another dose dependent change in the cell layers’ properties: it directly indicates morphological changes in the plasma membrane.

 

Dose dependent response in TEER and capacitance of MDCK-II cells to cholesterol depletion

Results of two independent experiments showing the dose dependent response in TEER and Ccl of MDCK-II cells to cholesterol depletion after 30 min. of exposure to MBCD.

The observed reduction in the total membrane capacitance caused by exposure to MBCD is exactly in line with independent investigations based on confocal microscopy [3]: these studies revealed that the depletion of cell cholesterol leads to the retraction of surface microvilli and microridges. Consequently, Ccl shows a significant, dose dependent decrease, since the cell layer’s electrical capacitance directly depends on the morphology of the plasma membrane. In particular, a retraction of protrusions such as microvilli and microridges causes a decrease of the effective surface area and thereby leads to a decrease of the electrical capacitance. The cellZscope is tailored to detect and monitor such changes in the plasma membrane during the full time course of an experiment.

 


nanoAnalytics thanks K. Hardes and K. Riehemann (Westfälische Wilhelms-Universität Münster) and J. Wegener (Universität Regensburg) for their  comprehensive support of this study.

[1] Stankewich, M., Francis, S.A., Vu, Q.U., Schneeberger, E.E., Lynch, R.D., Alterations in Cell Cholesterol Content Modulate Ca2+-Induced Tight Junction Assembly by MDCK Cells. Lipids 31, 817 (1996).
[2] Francis, S.A., Kelly, J.M., McCormack, J., Rogers, R.A., Lai, J., Schneeberger, E.E., Lynch, R.D., Rapid reduction of MDCK cell cholesterol by methyl-ß-cyclodextrin alters steady state transepithelial electrical resistance. Eur. J. Cell. Biol. 78, 473 (1999).
[3] Colarusso, P., Spring, K.R., Reticulated Lipid Probe Fluorescence Reveals MDCK Cell Apical Membrane Topography. Biophys. J. 82, 752 (2002).